撰写：生信大师姐 来源：小张聊科研平台的“ i生信”公众号，微信公众号搜索“ i生信”即可关注/扫描关注见文末
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昨天给大家分享了如何围绕一个主角基因，进行花式探究，进而封神（单方面官宣，这是单基因生信研究天花板！），今天继续分享从单基因入手探究疾病异质性的研究案例（单个基因就能决定疾病的异质性？？？No！！！要多个基因才行~~~那么从单个基因开始，如何合理化转变到多个目标基因？？？基于相关性分析？？？No！！！），文章标题：CAPN8 involves with exhausted, inflamed, and desert immune microenvironment to influence the metastasis of thyroid cancer。
doi:10.3389/fimmu.2022.1013049
研究背景
甲状腺癌（THCA）是内分泌系统最常见的恶性疾病，5年生存率可达95%左右，但转移患者的预后较差。CAPN是一种广泛存在于大多数真核细胞中的半胱氨酸蛋白激酶，在调节细胞周期和凋亡中起着关键作用。已有研究，CAPN的异常表达通过诱导NF-kB、局灶性粘附激酶和MYC通路参与多种类型的癌症进展。然而，关于CAPN8在甲状腺癌发生发展中的作用还知之甚少。
研究思路
首先，作者在公共数据集和体外肿瘤组织中探究了CAPN8的表达趋势及其预后价值。其次，作者根据CAPN8的表达及相关通路的活性，确定了甲状腺癌的免疫亚型。最后，作者探究了三种免疫亚型在基因组水平、药物敏感性和免疫治疗响应上的区别。
研究结果
Step1：探究甲状腺癌中CAPN8的表达趋势、预后价值、生物学功能和免疫特征
作者首先基于临床样本检测，发现CAPN8在甲状腺癌组织中蛋白表达水平和mRNA表达水平均显著升高。
随后，为了探究甲状腺癌中CAPN8的预后价值，作者将TCGA中甲状腺癌样本分为CAPN8高表达组和CAPN8低表达组，进而探究了两组样本间的生存差异，结果发现CAPN8高表达组患者的生存明显较差，结果表明CAPN8在甲状腺癌中可能起到癌基因的作用。
最后，为了进一步探究CAPN8在甲状腺癌中生物学功能，作者对CAPN8高表达组和CAPN8低表达组之间的差异表达基因进行了筛选，通过对差异表达的基因进行功能富集（GSEA分析，所以geneset为cancer hallmarks term中的基因集，并将显著富集的通路定义为差异表达的cancer hallmarks term，划重点，Step2中作者还要用到），作者发现，干扰素反应、炎症反应、E2F-targets等通路在CAPN8高表达组中显著激活。
为了探究甲状腺癌中CAPN8的表达是否与免疫治疗响应有关，作者首先探究了CAPN8与免疫调节因子之间的相关性，结果发现两者存在较高的相关性；其次在免疫治疗数据队列中探究了CAPN8表达与免疫治疗响应之间的关系，结果发现免疫治疗有响应的患者和免疫治疗无响应的患者中CAPN8的表达水平存在显著差异。以上结果表明CAPN8可能是免疫治疗响应的预测因子。
Step2：筛选甲状腺癌中CAPN8相关cancer hallmarks term
Step1中作者发现CAPN8在甲状腺癌中可能起到癌基因的作用，为了进一步阐明CAPN8对甲状腺癌细胞的潜在调控机制，作者分别使用LASSO和随机森林算法筛选了预后相关的且Step1中差异表达的cancer hallmarks通路。最终LASSO和随机森林算法分别筛选出6个及8个CAPN8相关cancer hallmarks term。
Step3：识别甲状腺癌的E2F相关亚型
为了进一步探究CAPN8是否影响甲状腺癌的异质性，作者基于CAPN8相关基因对甲状腺癌样本进行了聚类分析，这里的CAPN8相关基因不是基于相干性筛选的哦~详见下文：
作者对Step2中LASSO和随机森林算法分别筛选出的6个及8个CAPN8相关cancer hallmarks term进行了VENN分析，最终得到3个交集cancer hallmarks term。
进一步分析发现，E2F-targets通路影响甲状腺癌的RFS预后且与THCA患者的死亡率呈正相关。这些结果表明，E2F-targets通路可能是CAPN8的下游信号通路，在甲状腺癌的进展中起着关键作用。
最后作者基于E2F-targets通路富集的相关基因对甲状腺癌样本进行了聚类分析，并将甲状腺癌分成了两个疾病亚型，其中cluster1显著高表达E2F-targets通路相关基因及主角基因CAPN8，且预后较差。这一结果进一步支持了CAPN8可能通过调节E2F-targets通路导致甲状腺癌进展。
Step4：识别甲状腺癌的免疫相关亚型
除了上述基于E2F-targets通路相关基因进行甲状腺癌疾病分型外，鉴于两个cluster间免疫细胞浸润情况及免疫检查点基因表达模式存在差异，作者还探究了甲状腺癌的免疫分型，即免疫炎症型、免疫排除型和免疫沙漠型（不同免疫分型间的基本特征详见：传统的干湿结合如何看齐最in的研究方向，研究背景部分）。
Step5：探究不同甲状腺癌亚型之间的差异特征
随后作者进一步探究了不同甲状腺癌亚型在基因变异、DNA复制应激、化疗药物敏感性上的差异，并基于外部数据集进一步验证了分型的稳定性。
小编有话说
回复开篇提到的问题：如何从一个基因实现多个基因的转变，进而研究疾病的异质性。
一般用GSEA富集分析的时候，是对全部表达矩阵进行的，这篇文章中，作者选择对CAPN8高表达组和CAPN8低表达组之间的差异表达基因进行GSEA分析，并将显著富集的通路定义为差异表达的cancer hallmarks term，最后进一步通过LASSO和随机森林筛选预后相关的通路，最终得到了CAPN8相关的cancer hallmarks term，进而用相关的cancer hallmarks term上富集到的基因进行了疾病异质性的分析。
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